Как делается пцр анализ

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Сферы применения метода в клинической медицине

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

  1. Урогинекология . Для инфекционных заболеваний такого рода характерны слабая выраженность симптомов и хроническое течение, нередко вызывающие бесплодие и невынашивание беременности у женщин. С помощью ПЦР можно выявить наличие целого «букета» половых инфекций: хламидиоза, нескольких видов микоплазмы, уреаплазмы, трихомониаза, гарднереллы, кандиды, гонококка, трепонемы. Кроме этого, ПЦР-диагностике поддается и группа вирусов, поражающих урогенитальный тракт у обоих полов, в особенности, вирус герпеса и вирус папилломы человека. Их своевременное выявление и лечение помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.
  2. Неонатология . Существует множество микроорганизмов, способных поражать плод еще в утробе матери. ПЦР-диагностика позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.
  3. Служба крови . Чтобы избежать риска переливания, пациентам инфицированной опасными заболеваниями крови или плазмы (ВИЧ, сифилис, гепатиты) также используется метод ПЦР. Он значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.
  4. Клиника инфекционных заболеваний . К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.
  5. Фтизиатрия и пульмонология . ПЦР-диагностика позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, с ее помощью можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР используется также для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Преимущества ПЦР-диагностики

Хотя ПЦР-диагностика и является относительно «молодым» методом, широкое распространение в медицинской практике она получила благодаря явным преимуществам перед другими способами анализа:

  • Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
  • Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
  • Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
  • Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
  • Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
  • Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.
Читайте также:  Народная медицина мужская сила

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

  • Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
  • Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
  • Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Этапы исследования методом ПЦР

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

  1. Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
    • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
    • Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
    • Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
    • Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
    • Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
    • Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
    • Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
    • Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
    • Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
    • Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
    • Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.
    Читайте также:  Можно ли заразиться вич через глаза

    Цены на ПЦР-диагностику

    Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

    Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

    Название анализа Цена, руб.
    Определение ДНК хламидия 750
    Определение ДНК микоплазмы хоминис 540
    Определение микоплазмы гениталиум 350
    Определение ДНК уреаплазмы 350
    Гонококк, определение ДНК 350
    Определение ДНК герпеса (разные типы) 350–600
    Определение ДНК кандиды 570
    Вирус краснухи, определение РНК 800
    Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы) 350–1900 [1]

    Итак, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно. В пакет услуги диагностики включается сразу несколько анализов, например, «ПЦР-8» (8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) — 1400 [2] рублей или «ПЦР-12» (12 половых инфекций) — 3500 [3] рублей. Такая услуга позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку при отдельном прохождении ПЦР-диагностики по каждой инфекции затраты будут намного больше.

    Наши преимущества:

    • Недорого прием врача от 900 рублей
    • Срочно анализы в день обращения от 20 минут до 1 дня
    • Близко 5 минут от метро Варшавская и Чистые пруды
    • Удобно работаем каждый день с 9 до 21 каждый день (включая праздники)
    • Анонимно!

    Анализ ПЦР — самый чувствительный и точный метод, используемый для диагностики инфекций, передающихся половым путем. Его применяют не только при ЗППП, но и для оценки микрофлоры влагалища, кишечника, дыхательной системы. Сроки ПЦР различны для разных инфекций и зависят от варианта выполнения анализа: качественного или количественного.

    Сколько готовится анализ ПЦР больше всего волнует, конечно же, пациентов с венерическими заболеваниями или с подозрением на них. Потому что очень важно и вовремя начать лечение, и не заразить близких людей.

    Для большинства половых инфекций срок выполнения качественного ПЦР анализа, который как раз и определяет наличие той или иной инфекции, составляет 1 день. За сутки можно обнаружить хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, гарднереллы, трихомонады, гонорею, герпес, цитомегаловирус, ВПЧ, кандиду и многие другие виды микроорганизмов, вызывающих ЗППП. Материал для исследования — это обычно:

    1. Соскоб из уретры, с головки полового члена или влагалища.
    2. Соскоб со слизистой оболочки ротоглотки, конъюнктивы, прямой кишки.
    3. Соскоб с эрозий и язвочек.
    4. Моча.
    5. Секрет простаты, сперма.
    6. Мокрота, слюна.

    Несколько дольше выполняются количественные анализы ПЦР, которые определяют не только возбудителя, но и его количество на слизистой оболочке или в биологической жидкости. Срок такого ПЦР анализа 2–3 дня.

    ДНК диагностика ИППП проводится не только при помощи соскобов. Для ряда инфекций берут кровь и определяют наличие вирусов в 1 мл. Такие исследования необходимы при обследовании на ВИЧ, гепатиты, ЦМВ, , токсоплазмоз.

    Сколько дней делают ПЦР на ВИЧ волнует не меньше, чем при диагностике бактериальных ЗППП. Дело в том, что этот анализ является самым ранним из анализов на СПИД/ВИЧ и показывает наличие РНК вируса иммунодефицита, когда остальные анализы еще не реагируют.

    Читайте также:  Руки сохнут и чешутся

    Качественные ПЦР анализы крови на ВИЧ, гепатиты и другие инфекции в основном делаются до 3 дней. Количественные могут занимать 5–7, иногда до 14.

    Сколько готовится анализ ПЦР зависит не только от вида выявляемого вируса или бактерии, но и от лаборатории, которая его выполняет. В наших клиниках доставка исследуемого материала производится в течение нескольких часов непосредственно в лабораторию. Поэтому сроки ПЦР в режиме реального времени минимальны, а точность исследования составляет 99–100%. Анализы наших пациентов проводятся только в тех лабораториях, которые наилучшим образом зарекомендовали себя в выполнении анализа ПЦР.

    Быстрее, чем описано в данной статье, анализ ПЦР выполняться не может в силу своей технологии, так как для выращивания цепочек ДНК или РНК необходимо время.

    Диагностика методом ПЦР на сегодняшний день является самым эффективным способом обнаружения и идентификации возбудителей половых инфекций в человеческом организме.

    В этой статье мы разберем, что такое анализ ПЦР, как и где сдать этот тест.

    Вы узнаете, какова цена этого исследования, где выполняют ПЦР анализы и как готовится, когда требуется сдать ПЦР анализ.

    Вы узнаете о методиках забора мазков, какой врач берет анализы на ПЦР и почему медсестра плохо берет мазки на ПЦР анализ.

    Разберем ПЦР анализ: что это такое и как выполняют это исследование.

    ПЦР анализ: что это такое?

    ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей.

    В них происходит анализ на предмет присутствия возбудителей инфекционных, паразитарных или вирусных заболеваний.

    Суть ПЦР состоит в многократном «клонировании» находящихся в исследуемом материале фрагментов ДНК инфекционного агента.

    ПЦР диагностика инфекций считается наиболее быстрым, современным методом.

    ПЦР диагностику используют повсеместно.

    Все ведущие клиники используют диагностику ПЦР для верификации инфекционных заболеваний.

    Часто пациенты спрашивают, какие именно заболевания можно выявить при помощи метода ПЦР диагностики?

    Диагностика методом ПЦР используется для выявления широкого спектра возбудителей.

    Как делают ПЦР анализ?

    Такое исследование проводится одинаково для диагностики любого заболевания.

    Разница может быть лишь в исследуемом субстрате.

    Для этого пробирку с биоматериалом помещают в реактор, где с помощью катализаторов происходит процесс копирования молекул ДНК возбудителя инфекции.

    ПЦР диагностика: расшифровка

    Давайте разберем, как проводится расшифровка ПЦР диагностики.

    Метод ПЦР очень быстрый и простой.

    В качестве результата, вы получаете заключение врача лаборанта.

    В результате четко будет прописано: получен положительный результат или отрицательный.

    Ответ приходит на конкретную инфекцию.

    Когда вы сдавали палитру инфекции напротив каждого возбудителя будет указано получен положительный или отрицательный результат.

    Если вы сомневаетесь в результатах, покажите бланк вашему лечащему врачу.

    Доктор поможет интерпретировать результат ПЦР и подберёт правильное лечение.

    Помните!Исследование методом ПЦР не всегда можно использовать в медицинской практике.

    Такие исследования не проводятся при контрольном тестировании после проведения лечения.

    Когда берется ПЦР анализ после лечения, при разных инфекциях, можно получить положительный результат, который будет ложным.

    Это связано с тем, что частички убитых возбудителей, уже неактивные, могут давать положительную реакцию.

    Если вы сомневаетесь, можно ли вам сдавать ПЦР или нет, проконсультируйтесь с врачом.

    Разберем, какие материалы могут быть применены для тестирования ПЦР.

    в качестве материала для исследования методом ПЦР

    Что может быть использовано в качестве материала для исследования методом ПЦР:

    Врач всегда рекомендует определенные анализы.

    Тем не менее, существует определенный перечень материалов, которые покажут наиболее точные результаты.

    Тем не менее, существует определенный перечень материалов, которые покажут наиболее точные результаты.

    • Соскобы со слизистых оболочек (чаще всего уретры, влагалища, шейки матки). Их исследуют, главным образом, для диагностики половых инфекций. Таким способом во взятом мазке можно обнаружить возбудителей уреаплазменной и микоплазменной инфекций, гонококки, хламидии, трихомонады, гарднереллы, грибки рода Cand >Моча . Ее можно использовать в диагностике урогенитальных инфекций. ПЦР анализ мочи является альтернативой исследованию мазка из уретры для мужчин. Это особенно подходит тем пациентам, которые боятся болезненного взятия уретрального мазка.

    • Бронхиальная слизь . Может исследоваться с целью диагностики респираторных форм хламидийной и микоплазменной инфекций.
    • Кровь. Анализ крови ПЦР – это один из самых точных способов выявления в организме некоторых патогенных вирусов.

    Такое исследование позволяет диагностировать:

    • вирусные гепатиты
    • генитальный герпес
    • цитомегаловирусную инфекцию
    • ВИЧ
    • Другие биологические жидкости: секрет предстательной железы, околоплодная жидкость, слюна и др.
    Adblock detector